来源：百小蓁发布时间：2025-11-26浏览量：1次
▶ 发表时间：2025年11月21日
▶ 期刊：ACS Catalysis (IF 13.1)
▶ 发表团队：中国农业科学院
▶ 文章标题：ESTEEM Strategy: Revolutionizing Enzymatic Catalysis through the Evolutionary Gateway of Enzyme Tunnels
▶ 核心内容：
在理性蛋白设计领域，如何将进化信息与动态构象分析相结合，是突破酶工程瓶颈的关键。近日，中国农业科学院的团队发表于《ACS Catalysis》的研究提出了名为ESTEEM的创新策略，并借助氢氘交换质谱（HDX-MS） 这一关键技术，首次从实验层面直接揭示了底物隧道构象动力学在催化效率提升中的核心作用，为高效生物催化剂的设计提供了全新范式。
尽管计算模拟能够预测隧道几何形状的变化，但这些预测亟需在原子分辨率下、在溶液环境中进行实验验证。ESTEEM（Evolutionary-Structural Tuning of Enzyme Efficiency Modules）策略的提出，正是为了应对这一挑战。该策略通过整合进化保守性分析与三维结构特征，精准定位对酶功能具有潜在调控能力的非保守残基。
图1. ESTEEM策略之筛选促酶活突变位点
本研究以细胞色素P450单加氧酶CYP107Hb.am为模型。通过ESTEEM策略，研究团队筛选出位于底物隧道瓶颈区的两个非保守残基Ile67和Gln83, 经两轮迭代饱和突变，获得双突变体CYP107Hb.amI67DQ83H。 该变体展现出令人瞩目的催化性能提升：总周转数（TTN）提升106倍，催化效率提升82倍，耦合效率从0.6%大幅提升至69.85%，热稳定性同步提高。
图2. CYP107Hb.am的突变位点筛选图示（上图A/B）与各个氨基酸位点打分结果（下图A/B)
性能的提升需要机制的阐明。研究团队采用了一系列手段，其中氢氘交换质谱（HDX-MS）在揭示变体动态构象变化方面发挥了不可替代的作用。 1. 技术原理 HDX-MS通过测量蛋白质主链酰胺氢与氘代溶剂中氘的交换速率，来定量分析蛋白质不同区域的构象动态性与溶剂可及性。氘摄取率的降低表明该区域结构刚性增强或溶剂可及性降低；反之，则表明柔性增加。 2. 核心发现 通过对野生型及双突变体进行HDX-MS分析(图3)，研究获得了以下关键发现： I67D突变诱导刚性化：位于B-B’环的I67D突变导致该区域肽段的氘摄取率显著降低（从~24%降至12%），表明该突变稳定了隧道瓶颈区的局部构象，减少了无效波动(图3A, 3C)。 Q83H突变引入局部柔性：与之相对，B’螺旋上的Q83H突变则使其所在肽段的氘摄取率升高（从~12%增至19%），提示该区域动态性增强(图3A, 3C)。 协同效应与远程调控：双突变体呈现出一种“刚柔并济”的协同动态模式：B-B’环与F-G loop的刚性增强，而B’ helix的适度柔性化，共同优化了隧道的整体构象。相关性分析进一步显示，这些关键区域的运动模式从互不相关转变为高度协同 (图3D)。 图3. HDX-MS技术阐明CYP107Hb.am突变体关键区域的结构刚柔变化 结合自适应导向分子动力学（ASMD）模拟与HDX-MS实验数据，研究提出了一个令人信服的机制模型：ESTEEM策略所筛选的隧道残基突变，并非简单地扩大隧道尺寸，而是通过重新平衡隧道关键区域的刚性-柔性关系，塑造了一个几何结构更优、动态更稳定的底物传输路径。这种“动态变构”效应降低了产物解离过程中的自由能垒 (图4C，PMF降低近20 kcal/mol)，从而极大地提升了催化周转速率。ASMD模拟直观地展示了产物沿此优化路径的排出过程 (图4B)。 图4. CYP107Hb.am突变体的平均力势能PMF降低 这项工作标志着酶工程正从对静态结构的依赖，迈向对动态构象进行理性设计的新阶段。同时，HDX-MS技术有望在该领域发挥更多、更广泛的应用，解密酶改造后的结构动态变化，为酶工程设计提供基于蛋白结构方面的实验论据。 百蓁生物提供全套的 HDX-MS 服务体系，以发现各种类型样品，例如单克隆抗体(mAb)、抗体-药物偶联物(ADC)、病毒衣壳、生物仿制药等蛋白质构象、动力学、相互作用的信息，可用于生物仿制药评价、治疗性蛋白质QC、药理学研究等应用领域。 服务优势： 经验丰富：5年+专业团队经验，100+成功项目，助力发表10+高分文章。 预实验保障：独家免费定制化预实验，确保正式实验高效推进。 深度数据解析：自主PEAKS®软件平台精准分析，提升肽段覆盖率和数据准确性。 全流程优化：一站式服务+人工谱图校正，保证结果高重现性、高准确性和高稳定性。 可视化呈现：丰富图表结合pyMOL/Chimera蛋白结构渲染，提升结果直观性与可读性。 图5. HDX-MS结果展示形式HDX-MS：从性能提升到机制解析的关键桥梁
整合机制模型：隧道动力学的精准调控
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