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客户成果丨蛋白从头测序助力真核基因在细菌中激活机制的解析

来源:百蓁生物发布时间:2025-01-10浏览量:14

水平基因转移在所有生命领域中都已发生,并对原核生物和真核生物的进化做出了重要贡献。以前的研究表明,许多水平转移的真核基因为细菌受体提供了选择性优势,但这些真核基因如何进化成功能性细菌基因尚不清楚,尤其是细菌如何克服由真核内含子引起的表达障碍。 

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2024年7月,中国科学院天津工业生物技术研究所李志超研究员Nucleic acids research(IF 16.6)在线发表了Rapid functional activation of horizontally transferred eukaryotic intron-containing genes in the bacterial recipient,该研究利用实验进化策略对真核生物基因如何突破表达系统不兼容障碍并被快速激活的分子机制进行了探索性研究,百蓁生物为本研究提供了蛋白质从头测序检测与分析的服务

 

研究方法:

研究人员将来自不同来源的典型真核内含子插入到一个在真核生物中常用的ble-RFP融合抗性标记基因中,内含子的存在确实使这个抗性标记基因在大肠杆菌中失活,即使它可以有效地转录。随后进行了大规模遗传筛选以获取功能的获得,激活事件在几天的选择性培养中迅速发生。分子分析揭示了大多数激活事件是由于基于部分内含子序列删除的终止密码子移除突变。然而,一个保留完整内含子(富含终止密码子)的单碱基删除突变也导致了功能激活。蛋白质从头测序显示,单碱基删除导致产生两个分裂的小蛋白,这是基于内含子下游编码序列的翻译重新启动,分裂蛋白可以通过蛋白-蛋白相互作用恢复基因功能。种内含子介导的分裂蛋白翻译和相互作用的机制不仅适用于ble-RFP基因,还适用于其他两个标记基因,暗示这可能是一个常见的现象,有助于在转移基因获得真核表达特征之前快速激活其功能。百蓁生物为本研究提供了蛋白从头测序的检测和数据分析服务。 

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真核生物含内含子基因在细菌中激活的分子机制

研究结果:

1. 真核生物内含子的存在因翻译故障而使水平转移的基因失活

为了证实成熟的mRNA中保留的内含子会中断细菌中的翻译,我们将典型的真核生物内含子插入到ble-RFP基因(在真核生物中,如藻类中常用的融合标记基因)中,形成bleIN-RFP,如图1A所示。然后我们使用35S启动子在烟草叶中瞬时表达这个bleIN-RFP构建体,分析显示内含子从成熟的mRNA中被剪接掉,同时也可以观察到RFP荧光。相反,当我们使用细菌启动子在大肠杆菌中表达相同的bleIN-RFP构建体时,内含子被保留在mRNA中,无法检测到RFP荧光(图1B)。ble基因(zeocin抗性)的功能也因内含子在大肠杆菌中受到干扰。这些结果表明,真核生物内含子的存在并不影响水平转移基因的转录,但导致了翻译的变化,从而使转移的基因失活。

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1. 真核生物内含子基因在大肠杆菌中功能性激活的遗传筛选

2. 水平转移的真核生物内含子含基因在细菌受体中的功能激活的遗传筛选

为了系统研究内含子的效果,在大肠杆菌中测试多个不同来源和长度的真核生物III型内含子,发现这些内含子均能使ble-RFP基因失活。然而,无论是质粒携带还是基因组整合的内含子含基因都能通过实验进化迅速恢复功能,共观察到九个激活事件。进一步的分子机制分析揭示了两种激活机制:一是内含子中的终止密码子被移除,二是保留完整内含子但通过单碱基删除突变恢复功能。这些发现表明,真核生物内含子含基因的水平转移后在细菌中的功能性激活是可能的,且质粒携带和基因组整合基因在恢复功能性上共享相似的分子机制。

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2. 水平转移的内含子基因在大肠杆菌中翻译激活的分子重排

3. 单碱基删除突变导致了功能性激活

研究者通过将Ec-bleIN-RFP-A8及其起始菌株的表达盒克隆到另一个载体并转入不同的大肠杆菌株中,发现A8菌株中的bleIN-RFP蛋白产生了两个额外的小蛋白P1和P2,这两个蛋白分别对应于内含子上游和下游的编码区域。蛋白质从头测序揭示,纯化的部分由一个9-kDa蛋白(P1)和一个33-kDa蛋白(P2)组成。为了确认Ec-bleIN-RFP-A8表达了两个小蛋白(P1和P2),A8的总蛋白及其纯化的His标记蛋白部分进行了SDS-PAGE分析,揭示总蛋白确实包含两个独立的蛋白(图3E),与从头蛋白质测序的结果一致。

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3.保留完整内含子的单碱基删除突变导致了两个分裂的小蛋白的产生

4. 分裂蛋白的共表达恢复蛋白的功能

研究者通过实验发现,两个分裂的小蛋白P1和P2可以通过共表达来恢复ble-RFP蛋白的功能。单独表达P1或P2并不能产生zeocin抗性,只有两者共表达时才能恢复抗性(图4)。通过缺失筛选和Y2H系统分析,研究者揭示了P1和P2之间的相互作用机制,特别是内含子编码的位于P2 N端的八个新氨基酸在这一过程中起到了关键作用。蛋白质-蛋白质对接模拟进一步证实了P1和P2之间通过强氢键和盐桥相互作用,而不是通过二硫键或其他共价键。

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4. 两个分裂的小蛋白(P1和P2)的共表达通过形成蛋白复合体恢复ble-RFP的功能

总的来说,本研究揭示了水平转移的真核生物内含子含基因在细菌受体中功能性激活的遗传机制,发现了两种不同的分子机制和多种DNA重排模式,表明这些基因如果为细菌提供了选择性优势,可能迅速获得功能性。这项发现不仅加深了我们对水平基因转移机制的认识,还可能对转基因技术在细菌中的应用产生积极影响。

 

百蓁生物是一家以AI驱动质谱技术、聚焦精准医疗的生物科技公司,拥有BSI授权的质谱抗体测序技术、自主知识产权的 PEAKS®系列分析软件和经验丰富的质谱技术经验。早在2013年,专注于de novo算法应用的BSI公司提出了“基于质谱方法,对未知蛋白质进行从头测序”,并于次年首次提供抗体蛋白测序的商业化服务,于2016年全球首次实现对单抗进行全自动从头测序,推动生物药质谱精确深度表征。百蓁生物作为蛋白从头测序技术的发明者,目前已完成数千个抗体和重组蛋白的测序和鉴定服务。

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服务优势:

:抗体/蛋白序列100%准确

:抗体/蛋白从头测序和糖基化的分析步到位,解析生物药更全面的信息;

:强大的糖肽解析能力,如发现CDR区域的关键糖基化修饰等;

:深入发现每一个糖基化位点,提供基于位点的糖型结构及比例。

 


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