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干货分享丨免疫沉淀(IP)与酸洗脱(MAE)分离方法免疫肽结果的比较

来源:百小蓁发布时间:2024-09-14浏览量:11

主要组织相容性复合体(MHC)负责在细胞表面呈递数千种肽,这些MHC结合肽(MBP)不仅在适应性免疫的功能研究中发挥作用,而且是可用于癌症免疫治疗的新抗原的来源,如疫苗或细胞疗法。近年来,质谱技术的发展使直接检测MHC在细胞表面呈现的MBP成为可能,为快速准确地鉴定免疫肽提供了一种新的工具。如图1所示,首先通过泛MHC免疫沉淀(IP)从肿瘤组织或细胞系中分离MHC复合物,随后进行洗脱以去除未特异性结合的肽段,然后使用酸性洗脱缓冲液将结合的抗原肽从MHC分子和抗体上解离,洗脱后的肽段进行质谱检测,用于免疫肽组检测和新抗原的发现。

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1. 基于质谱技术对肿瘤患者免疫肽谱分析的工作流程[1]



温和酸洗脱(MAE)是另一种分离MHC和抗原肽的策略,可以在短时期内直接从细胞膜中洗脱MHC肽段,在低pH的温和酸性条件下改变MHC-I(β2-微球蛋白)的空间结构,从而释放结合的肽段。MAE的主要缺点是非特异结合肽的比例较高,这增加了假阳性的数量并降低了该方法的特异性。通常,MHC-IP方法鉴定的肽段数量和特异性高于MAE的结果。

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2. MHC与肽段复合物的分离方法酸洗脱(MAE)和免疫沉淀(IP[2]



自20世纪90年代初,通过质谱鉴定MHC免疫肽已经为MHC分子全局抗原呈递的特性提供了深入的见解,也是MHC和抗原肽特异性结合模式最强有力的证据之一,Zhang X等研究人员总结了从1990年到2019年发表的40篇基于质谱技术的MHC免疫肽组相关的文献(表1)。与MAE(温和酸洗脱)相比,IP(免疫沉淀)已成为主要的抗原肽分离方法。DDA(数据依赖采集)是最广泛使用的免疫肽检测的方法。靶向SRM/PRM(选择反应监测/并行反应监测)方法主要用于少量抗原肽的验证或绝对定量。尽管DIA(数据独立采集)已被证明比DDA具有更深的肽段的覆盖,但由于DIA数据解释的复杂性,DIA仍未成为免疫肽检测的主要方法。

表1. 基于质谱技术MHC免疫肽相关文献的总结[3]

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百蓁生物对免疫沉淀(IP)和酸洗脱(MAE)的分离方法进行了对比,结果如图3所示[4]。活细胞(living cell)IP免疫肽鉴定的结果是MAE鉴定结果的3倍以上,而且IP 鉴定到免疫肽的类型能够覆盖大多数MAE和MAE-IP免疫肽的类型(~75%)。此外,MAE鉴定结果中有结合肽段的比例明显低于IP的结果,特别是冻存细胞,MAE鉴定到更多的非特异性结合的肽段,污染物肽的比例较高。


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图3.免疫沉淀(IP)和酸洗脱(MAE)免疫肽鉴定结果比较。

A. 免疫肽鉴定数目;B. 免疫肽的结合情况;C.有结合免疫肽的重叠率。

总的来说,免疫沉淀IP的分离方法,适合所有的样本类型,如组织或细胞样本,而且免疫肽鉴定深度高且特异性强。MAE的分离方法仅对细胞样本比较适用,特别是活细胞的样本,在冻存的细胞类型上效果更差。

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参考文献:


[1]Zhang X, Qi Y, Zhang Q, Liu W. Application of mass spectrometry-based MHC immunopeptidome profiling in neoantigen identification for tumor immunotherapy. Biomed Pharmacother. 2019.

[2]Kote, Sachin, et al. Mass spectrometry-based identification of MHC-associated peptides. Cancers, 2020

[3]Zhang X, Qi Y, Zhang Q, Liu W. Application of mass spectrometry-based MHC immunopeptidome profiling in neoantigen identification for tumor immunotherapy. Biomed Pharmacother. 2019.

[4]Distinguishing MIP Profiling by MS with immunoprecipitation and Mild Acid Elution methods. P. Wu., H. Miao., et. al. TP 576, 72nd ASMS Conference, Anaheim, California, 2024


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